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按照〉a href="//www.sqrdapp.com/law/show-189682.html" target="_blank">食品补充检验方法工作规宙/a>》，《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》食品补充检验方法已经国家食品药品监督管理总局批准，现予发布、/div>
特此公告、/div>
食品药品监管总局
2017??5?/div>
附件
植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS 201707
1 范围
本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法、/div>
本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定、/div>
2 原理
提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分、/div>
3试剂和材斘/div>
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无
DNA酶污染的容器分装、/div>
3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为９/div>
核桃5端引物：5-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3
核桃3端引物：5-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3
核桃探针?-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3
3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为９/div>
花生5端引物：5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3
花生3端引物：5-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3
花生探针?-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3
3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为９/div>
杏仁5端引物：5-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3
杏仁3端引物：5-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3
杏仁探针?-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3
3.4芝麻源性成?S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为９/div>
芝麻5端引物：5-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3
芝麻3端引物：5-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3
芝麻探针?-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3
3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为９/div>
榛子5端引物：5-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3
榛子3端引物：5-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3
榛子探针?-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3
3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为９/div>
大豆5端引物：5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3
大豆3端引物：5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3
大豆探针?-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3
3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为９/div>
内参?端引物： 5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3
内参?端引物： 5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3
内参照探针：5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3
3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB?400mmol/L NaCl?0 mmol/L EDTA?00 mmol/L Tris＋/div>
?0%盐酸调节pH ?.0?21℃高压灭?0 min, 备用、/div>
3.9 蛋白酶K?0mg/mL、/div>
3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）、/div>
3.11 异丙醇、/div>
3.12 70%乙醇、/div>
3.13 Taq DNA聚合酶、/div>
3.14 dNTP混合液、/div>
3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）?0mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）、/div>
3.16 10PCR缓冲液：200 mmol/L KCl?5 mmol/L MgCl2?00 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、/div>
4仪器和设夆/div>
4.1 组织研磨器、/div>
4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计、/div>
4.3 恒温水浴锅、/div>
4.4 离心机：离心?2,000g、/div>
4.5 微量移液器（0.5L~10L?0L~100L?0L~200L?00L~1000L）、/div>
4.6 实时荧光PCR仪、/div>
4.7 涡旋振荡器、/div>
4.8 天平：感?.01g、/div>
5分析步骤
5.1 试样总DNA的提叕/div>
固体样品：将样品粉碎后称?.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA、/div>
液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加? 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下?2,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA、/div>
?）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加?00 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K溶液，振荡混匀?5℃孵? h（过夜孵育更好） 期间每隔10 min振荡混匀：/div>
?）加?00 L的苯酚：氯仿：异戊醇?5:24:1），振荡抽提10 min，室温下?2,500 rpm 离心10 min：/div>
?）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀?2,500 rpm 离心10 min：/div>
?）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA：/div>
?）小心吸取上清，加入200 L氯仿：异戊醇?4:1），振荡抽提，室温下?2500 rpm 离心15 min：/div>
?）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀?2,500rpm 离心10 min：/div>
?）弃去上清液，沉淀?0% 乙醇洗涤，离?min，晾干，溶于50LTE 缓冲液中、/div>
5.2 DNA浓度和纯度的测定
?L DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应?.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增、/div>
5.3 实时荧光PCR扩增
反应体系总体积为25L，其?0PCR缓冲?L，正反向引物?0mol/L）各1L，探针（10mol/L?L，dNTPs?0mol/L?L ，Taq DNA聚合酶（2.5U?.2 L，DNA模板?0-100ng/L?L，用灭菌去离子水补足至总体?5L。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒、/div>
反应参数?0 2min 95 15min 95 15s 60 1min 40个循环、/div>
5.4 实验对照
检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系、/div>
6结果判断与表?/div>
6.1 质量控制
以下条件有一条不满足时，结果视为无效９/div>
（a）空白对照：无FAM荧光信号检出；
（b）阴性对照：无FAM荧光信号检出；
（c）阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct?le;35.0：/div>
（d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0、/div>
6.2 结果判定
（a）如Ct?le;35.0，则判定为被检样品阳性；
（b）如Ct?ge;40.0，则判定为被检样品阴性；
（c）如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍?5.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑、/div>
6.3 结果表述
结果为阳性者，结合产品标识，表述为检出XX源性成?rdquo;、/div>
结果为阴性者，结合产品标识，表述为未检出XX源性成?rdquo;、/div>
结果为可疑者，结合产品标识，表述为XX源性成分可?rdquo;、/div>
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7防污染措於/div>
检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行、/div>
本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院、/div>
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验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心、/div>
主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇、/div>
地区９/font>| 食品伙伴网提供标准法规解读、舆情监控、合规咨询、申报注册等服务、br/>电询?535-2129301 QQ?891238009 |
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声明９/p>
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