菌落总数检测技术要点

王中泰 · 发表于 2023-2-4 16:32

菌落总数检测技术要点

菌落总数

食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度，预测食品耐放程度和时间，估测出食品腐败状况，是食品卫生检测的重要指标，应该如何检测呢？

一、菌落总数的概念

（一）菌落总数

食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、 pH 、需氧性质等），所得 1mL （或 1g ）检样中形成菌落的总数。

按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 37 ℃培养 48h ，能在平板计数琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

（二）细菌总数

细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以 1g 或 1mL 或 1cm2 样品中的细菌总数来表示。

（一）样品的处理和稀释

1 、操作方法

（ 1 ）以无菌操作取检样 25g （或 25mL) ，放于 225mL 无菌生理盐水或其他无菌缓冲溶液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠 ) 或无菌均质袋内，经充分振要或研磨制成 1 ： 10 的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以 8000~10000r/min 的速度处理 1 ～ 2min ，制成 1:10 的均匀稀释液。

（ 2 ）用 1ml 灭菌吸管或吸头吸取 1:10 稀释液 1mL ，沿管壁徐徐注入含有 9mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的无菌试管内，振摇试管混合均匀，制成 1:100 的稀释液。

（ 3 ）另取 1mL 灭菌吸管或吸头，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用 1 支 1mL 灭菌吸管。

2 、无菌操作

操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用 75% 乙醇在包装开口处擦拭后取样。

操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露 15 分钟，每个平板不得超过 5 个菌落（具体的自己根据实际制定实验室的 SOP ）。

3 、采样的代表性

如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

4 、稀释液

样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或 0.1 ％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。

（二）倾注培养

1 、操作方法

（ 1 ）根据标准要求或对污染情况的估计，选择 1 ～ 3 个适宜稀释度，分别在制 10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1mL 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

（ 2 ）将凉至 46 ℃～ 50 ℃平板计数琼脂培养基注入平皿约 15 ～ 20mL ，并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有 1mL 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

（ 3 ）待琼脂凝固后，翻转平板，置 36 ± 1 ℃温箱内培养 48 ± 2h ，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

（ 4 ）倾注用培养基应在 48 ℃± 2 ℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，也可以以皮肤感受较热而不烫为宜。

倾注培养基的量规定不一，从 12 ～ 20mL 不等，一般以 15mL 较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察

（ 5 ）为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过 20min ，以防止细菌有所死亡或繁殖。

（ 6 ）一般适温较低，故多采用 36 ℃，培养时间一般为 48h 。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养 48h 后，培养基失重不应超过 15 ％。

（ 7 ）为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培养基混合的平板，不经培养，而于 4 ℃环境中放置，以便计数时作对照观察。

在某些时候，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（ TTC ），培养后菌落呈红色，易于分别。

（三）计数和报告

1 、操作方法

培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每 mL ）中的菌落数，进行报告。

2 、计数

到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于 0 － 4 ℃，但不得超过 24h 。

3 、稀释度选择及菌落数报告方式

（ 1 ）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。

（ 2 ）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（ l ）计算：

N= ∑ C/ （ n1+0.1n2 ） d ……………………（ 1 ）

式中：
N ―样品中菌落数；
∑ C ―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n 1 ―第一个适宜稀释度接种平板个数
n2 ―第二个适宜稀释度接种平板个数；
d ―稀释因子（第一稀释度）。

（ 3 ）若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

（ 4 ）若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（ 5 ）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

（ 6 ）若所有稀释度的平板菌落数均不在 30~300 之间，其中一部分小于 30 或大于 300 时，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4 、菌落总数的报告
（ 1 ）菌落数在 100 以内时，按“四舍五人”原则修约，采用两位有效数字报告。

（ 2 ）大于或等于 100 时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

（ 3 ）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

（ 4 ）称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。

（四）特别注意

1 、不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

2 、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。

3 、当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。