LC-MS/MS 分析中如何消除基质效应（五）：新技术进展与内标优化

王中泰

LC-MS/MS 分析中如何消除基质效应（五）：新技术进展与内标优化

为了减少磷脂产生的基质效应并去除其他内源性化合物，新技术正得到越来越多的开发。

最近，市场上出现了前景看好的蛋白沉淀板。Sigma-Aldrich 公司的混合 SPETM 蛋白沉淀（Hybrid SPE-PPT）技术和 Varian 公司的 Captiva NDTM-lipids 就是两个例子。此外，有报道称使用胶体硅胶（LUDOX? AS-40）和阳离子吸附剂或电泳样品制备可去除磷脂。

Sigma-Aldrich 声称，混合 SPEPPT 平台的氧化锆涂层颗粒可高效提取磷脂，同时对各种碱性、中性和酸性化合物保持非选择性。

事实上，与标准的蛋白沉淀法相比，混合 SPE-PPT 法可提取大鼠血浆样品中 99% 以上的磷脂。可乐定（Clonidine）和 Protrytiline 的例子表明，使用混合 SPE-PPT 板可消除标准蛋白沉淀后出现的严重电离抑制（>50% 的信号）。

根据制造商的评估，Hybrid SPE-PPT 去除磷脂的能力不受提取血浆量、洗脱溶剂中使用的有机改性剂或提取分析物所需的最佳 pH 值的影响。因此，中性、碱性和酸性化合物都能从磷脂中有效分离出来。
最近，Pucci 等人在大鼠和人体血浆中比较了使用乙腈的传统蛋白沉淀提取法和新型混合 SPE 蛋白沉淀提取法。混合固相萃取法大大降低了提取生物样本中磷脂的含量，从而显著降低了基质效应。

Varian称，Captiva ND-磷脂过滤板可去除生物液体中的 LPCs（溶血磷脂酰胆碱）和 PCs（磷脂酰胆碱），而不会保留相关的分析物。

Dicaire 等人使用不同比例（1:3、1:4 和 1:8[血浆：有机溶剂比]）的乙腈和甲醇对 Captiva ND-磷脂板进行了评估，结果表明，在测试的 14 种不同分析物中，大多数分析物的提取效率与相同条件下标准的蛋白沉淀法的回收率相似。

在大多数条件下，Captiva ND-磷脂板也能去除后期洗脱的 PCs。但是，对于共洗脱磷脂（LPC），其去除并不彻底。另一项研究对 Captiva ND-磷脂板和标准过滤板进行了比较，结果表明 Captiva ND-磷脂板的磷脂提取效率略低。此外，在使用 Captiva ND-磷脂时，甲醇比乙腈更能完全去除磷脂，因为乙腈与甲醇的比例只有 10:1（血浆：乙腈）时才有效。

Shoener 等人于 2006 年报道了在血浆样本中直接加入 LUDOX AS-40 和氯化锰（MnCl2）定量去除 PC 和 LPC 类磷脂的方法。然而，使用氯化锰作为阳离子吸附剂会大大降低分析物的提取效率。通过对 PC、PE（磷脂酰乙醇胺 ） 和 SM（鞘磷脂）磷脂类别的监测，对十种不同化合物进行了不同阳离子吸附剂与 Ludox AS-40 一起添加的评估。

图 1.磷脂的典型结构式

结果表明，就十种受测分析物的提取效率和磷脂去除率而言，使用氯化镧（LaCl3）和胶体硅胶是最佳条件。

96 孔板电泳样品制备程序是一种高通量的磷脂和盐类去除方法。在这种方法中，在 96 孔板中，相关分析物将被阳极吸引，穿过聚氨丙烯酰胺凝胶，最终被整体下层捕获，而磷脂（阴离子）将被阴极吸引并保持在溶液中。然后就可以移除整体捕获层，用 MALDI-MS/MS 进行分析，而没有磷脂的存在。最近，Grant 等人证实，在 pH 值为 1.9 的阳离子模式下对电泳样品进行分析，磷脂去除率可达 99.5% 以上。
稳定同位素内标（IS）

选择适当的 IS 对成功开发生物分析方法非常重要。然而，即使它能提高精密度和准确度，也不能减少或消除基质效应，因为它通过保持分析物与 IS 的比率不变来补偿分析物响应的损失或增加。
据报道，结构类似物与定量分析物的共洗脱可校正标准曲线中较高浓度下观察到的电离饱和。事实上，IS 与分析物的色谱共洗脱可形成线性标准曲线。

稳定的同位素标记 ISD（SIL-IS）被认为是校正基质效应的理想 IS，因为它们与其未标记的分析物具有几乎相同的理化性质。在相同或接近相同保留时间洗脱的 SIL-IS 和分析物会同时电离，并发生类似的基质效应。

SIL-IS 与类似物 IS 的比较表明，SIL-IS 在校正基质效应方面更具优势。血管紧张素 IV 的 SIL-IS 与血管紧张素 IV 的结构类似物进行了比较，以校正相对基质效应。在六个基质批次之间，SIL-IS 在 LLOQ 浓度上的差异为 5.2%，而类似物的 IS 为 28.5%。

另据报道，一种稳定同位素标记 IS 能有效纠正 ES-285（一种抗癌剂）的不稳定产物离子电离过程：从 ES-285 片段中得到了一个单一的产物离子，对应于其脱水[M+H-H2O]+。这种类型的产物离子不适合用于定量，因为经常会观察到过早的源内碎裂变成脱水产物离子，而且变化极大。使用 SIL-IS 对 ES-285 的源内碎片进行了校正，其源内碎片与 ES-285 相同，因此可将电离过程的变化降至 4.9%。

然而也有报道称 SIL-IS 无法校正基质效应。在某些情况下，SIL-IS 与分析物之间的色谱分离（即同位素效应）可能会导致两种化合物的电离过程不同。同位素效应是由于氘和氢的性质略有不同，这可能会导致 SIL-IS 与其未标记的分析物之间出现轻微的色谱分离。这种现象在含有大量氘和高分离效率 (k') 的 SIL-IS 中更为明显。

外消旋 2H5-卡维地洛和外消旋卡维地洛的部分手性色谱分离以及它们在一个大而尖锐的基质效应区域的洗脱，导致了这两种化合物之间不同的电离过程，因此2H5-卡维地洛在校正卡维地洛基质效应方面效率低下（图 2）。

图 2.柱后灌注卡维地洛（R 和 S 型混合物）并注入无药血浆提取物

与卡维地洛及其稳定的同位素标记 ISD 的 LC-MS/MS 色谱重叠图。观察到卡维地洛和2H5-卡维地洛的保留时间略有不同。
使用 SIL-IS 可能会给生物分析方法带来额外的变异来源。研究发现，13CD3-罗非昔布和罗非昔布之间的氘交换会降低方法的精密度和准确度。因此，必须注意的是，氘必须添加到不会发生交换的非酸性位置。最后，研究发现含 13C 的 SIL-IS 比氘形式更稳定。

总结
在 LC-MS/MS 生物分析方法中，磷脂或其他内源性化合物引起的基质效应会导致离子抑制或增强。因此，有必要在方法开发的早期阶段克服这一现象。

本系列列举了基质效应评估的不同技术。柱后灌注法和磷脂监测法是方法开发中最有用的工具，因为这些方法能在较少的实验中提供大量信息。

纵观本系列，方法开发人员能够找到色谱优化方面的最新技术。事实上，我们讨论了基本流动相、HILIC 色谱、超高效液相色谱和二维液相色谱在避免干扰内源化合物的离子抑制方面的作用。

此外，还从磷脂去除的角度对使用普通 LLE 和 SPE 进行样品萃取的优化进行了审查。还讨论了新技术的能力，如固相支撑蛋白沉淀板和在蛋白沉淀过程中使用胶体硅胶，以及 Turboflow 的可能性。
同时，还介绍了不同雷竞技百科 分析仪和电离模式的比较以及使用合适的 IS 的重要性。本系列提供了在方法开发过程中，评估基质效应的不同方法。

更重要的是，分析人员现在有了一份工具清单，可以帮助他们有效地消除或尽量减少基质效应。